Die Frösche produzieren nämlich in ihrer Haut ein giftiges Sekret, welches übel schmeckt und die Schleimhäute reizt, so dass Fressfeinde die Frösche in Ruhe lassen. Das Sekret hält gleichzeitig die Haut feucht und tötet Pilze und Bakterien ab, die dort vorzügliche Lebensbedingungen vorfinden würden. Auch unsere einheimischen Amphibien besitzen giftige Hautsekrete zum Schutz der Haut, die jedoch für uns Menschen ungefährlich sind und nicht wie im Falle des Feuersalamanders früher als „teuflisch gefährlich“ angesehen und mit „tödlicher Wirkung“ verbunden wurden.
Es gibt einige extrem giftige Pfeilgiftfroscharten. Die der Gattung Phyllobates, mit dem Spitzenreiter Phyllobates terribilis (lat. Der „Furchterregende“), sind am giftigsten. Sie werden von den Cholo-Indianern des Regenwaldes in Kolumbien noch heute zum Vergiften ihrer Jagdpfeile verwendet. Die Frösche werden aufgespießt und über ein Feuer gehalten. Normalerweise sondern sie nur wenige Mengen von dem Sekret ab, doch unter großem Stress wird so viel Sekret abgegeben, dass es zum Vergiften von 50 Blasrohrpfeilen ausreicht. Bei trockener Lagerung, sind solche Giftpfeile noch Jahrzehnte lang wirksam. Das Gift von Phyllobates terribilis reicht aus, um 20.000 Mäuse oder 10 Menschen zu töten.
Offensichtlich können Pfeilgiftfrösche ihr Gift nicht selbst produzieren, da in Terrarien gehaltene Tiere ungiftig werden. So besteht auch keine Gefahr für die Pfleger, die sich um die Pfeilgiftfrösche im Naturhistorischen Museum kümmern. Wahrscheinlich nehmen die Frösche in ihrer natürlichen Umgebung das Gift mit der Nahrung auf.
Aus der Haut verschiedener Pfeilgiftfroscharten konnte man bis zu 400 verschiedene Gifte nachweisen, wie z.B. Batrachotoxin, welches zu den giftigsten Naturstoffen zählt. Es ist 5.000 mal giftiger als Zyankali. Einige Froschgifte, wie das Tetrachotoxin, findet man auch in anderen Tieren, wie dem giftigen Kugelfisch. Die Gifte der Pfeilgiftfrösche sind auch Genestand der pharmazeutischen Forschung. Möglicherweise können daraus nebenwirkungsfreie Schmerzmittel hergestellt werden